Questo capolavoro di Caravaggio venne commissionato dal banchiere Ottavio Costa.
Ci mostra l'episodio biblico della decapitazione del condottiero assiro Oloferne da parte dell'ebrea Giuditta, che per salvare il proprio popolo dalla dominazione straniera prima si concede al nemico e poi, mentre questo dorme, lo uccide. Una vecchia serva osserva la scena con animo irrequieto, reggendo una cesta. Mentre Giuditta quasi si ritrae inorridita (sconcertata?) dal risultato della sua decisione, sul viso di Oloferne giace già la morte, il suo corpo invece teso in un ultimo spasmo di vita.
Caravaggio compie un passaggio da una visione statica ad una più dinamica della scena, accentuando la tragedia tra lo sfondo nero e la luce che rivela i volti e i loro stati d'animo. L'episodio biblico viene attualizzato dalle vesti contemporanee della giovane, che in origine era seni scoperti.
Si dice che Caravaggio abbia dipinto il quadro pensando alla storia di Beatrice Cenci, alla decapitazione della quale assistette di persona e probabilmente dal ricordo di questa trasse il mimetismo dello schizzo di sangue.
(Diversa la rappresentazione dello stesso soggetto di Artemisia Gentileschi)